COMET YÖNTEMİ

Prof. Dr. Semra Şardaş

Marmara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi,Toksikoloji Anabilim Dalı İstanbul

Bs200Pro yazılımı içerinde yer alan Comet Assay yazılımının kullanımı son derece kolaydır. Otomatik ve manuel ölçümler, histogram,  gerekli matematiksel hesaplamaları yapar.  

Name,kGy, CometArea, CometLength, CometHeight, CometIntensity, CometMeanInsety, HeadDiameter,  HeadLength, HeadArea, HeadIntensity, HeadMeanInsety,  %DNAHead, TealArea, TealIntensity, TealMeanInsety, TealLength, %DNATeal,TealMoment, ...

Çözüm: Elde edilen komet görüntüleri Bs200proP ile iki ayrı metotla analiz edilir. Kullanıcının seçimine bağlı olarak Otomatik veya yarı otomatik ölçüm metotları kullanabilir.

Gerekli Ekipman

• BAB Bs Comet Assay yazılımı

• Görüntü elde etmek için yüksek çözünürlüklü bir kamera. Kamera zayıf ışığa duyarlı olmalıdır( 0.05lux veya daha düşük) 

• Flüoresan Mikroskop

• BAB iş istasyonu

COMET YÖNTEMİ

Prof. Dr. Semra Şardaş

Marmara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi,Toksikoloji Anabilim Dalı İstanbul

Kanser gelişimi uzun yıllar sonucunda gerçekleştiğinden prospektif epidemiyolojik çalışmalar düzenlemek her zaman mümkün değildir.Bu sebeple kanser riskini belirleyebilecek özellikte biyogöstergelere ihtiyaç vardır.Çoğu insan karsinojeni genotoksikken,tüm genotoksik ajanların insanlarda karsinojenik olduğu gösterilmemiştir.Kanser gelişiminden önce genotoksisite ile karsinojenesite arasındaki ilişkinin belirlenmesi doğal olarak önem kazanmıştır.Bu amaçla geliştirilen çeşitli genotoksisite yöntemleri mevcuttur.Bunlardan en sık olarak son yıllarda comet tekniğinden yararlanılmaktadır.

yılında Östling ve Johanson tarafından geliştirilen teknik nötral pH’daki lizing şartlarında uygulanarak DNA çift sarmak kırıklarını tayin etmekteydi. 1988 yılında Singh ve arkadaşları tarafından protokolde birtakım değişiklikler yapılarak yöntem alkali lizing koşullarında uygulanmıştır.Singh ve arkadaşlarının comet yöntemi protokolü bugün küçük değişiklerle dünya genelinde en yaygın kullanılan genotoksisite protokolüdür.Yöntemin en önemli avantajlarından bir tanesi de çok çeşitli hücre tiplerinde çalışma olanağı sağlaması,in- vivo/in-vitro uygulanabilmesidir. Comet yönteminde hücreler izole edildikten sonra agar içine gömülerek mikroskobik lamlara yayılır,lizing aşamasından sonra elektroforeze bırakılıp florasan boya ile boyanmak suretiyle değerlendirilir.Comet tekniği ile DNA hasarının kantitatif olarak tayin edilmesinde , kuyruk uzunluğu,kuyruk momenti ve kuyruktaki DNA yüzdesi en yaygın kullanılan parametrelerdir.Kuyruktaki DNA yüzdesinin belirlenmesi ve sonuçların gözle değerlendirilmesi diğer parametrelere göre doz cevap ilişkisini daha iyi yansıtması sebebiyle tercih edilmektedir.Comet tekniği DNA hasarını izlemede uygun ve etkili bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, bireyin ,DNA onarım kapasitesini belirlemek içinde comet tekniğinden yararlanılmaktadır. Hasarlı DNA’nın onarılmaması kanser oluşumunun temel mekanizması olarak kabul edilir. Bu olay DNA onarım yetersizliğini ve kansere yatkınlığı dolayısıyla bireysel duyarlılığı belgeler. DNA onarım problemlerini saptayabilmek için Challenge tekniği ile kombine olarak comet tekniği hücrelerin radyasyona duyarlılıklarındaki farklılıklardan yola çıkarak ‘onarım’ olarak adlandırdığımız hasarın biyolojik prosesine bağlı olarak son yıllarda kullanılan hızlı ve güvenilir yöntemdir.Bunun yanısıra, okside olmuş pürin ve pirimidin bazlarının net göstergesi olarak bazı bakteriyel enzimlerin kombinasyonu ile  (örn; . formamidopyrimidine glycosylase, endonuclease III, uracil-DNA glycosylases  vs.) comet tekniğinden sağlık alanında yararlanmak mümkündür.  Genotoksikolojik,Ekotoksikolojik ve Biyoizleme araştırmalarında öncelikli kullanım alanına sahiptir.

1995 yılında Comet Tekniğini Gazi Üniversitesi,Eczacılık Fakültesi,Toksikoloji Anabilim Dalında kurduktan sonra,aynı yıl tekniği kullanarak yaptığımız yayın Uluslararası indekslere kayıtlı olan Mutation Research dergisinde yayınlandı.Türkiye den yayınlanan ilk comet tekniğinin kullanıldığı  araştırma olması bakımından araştırmada emeği geçen arkadaşlarıma teşekkür ediyorum.İlk çalışmalarımızda  bilgisayar destekli görüntü ve analiz .sistemi olmadığı için  DNA hasarını gözle değerlendirilerek,öküler içine yerleştirdiğimiz cetvel yardımı ile ölçüm yaparak  ,ve  hasar şiddetine göre kategorize edilerek değerlendirilme yapılmıştır..Ancak daha sonraki yıllarda yürütücüsü olduğum  proje kapsamında Anabilim Dalımıza yurt dışından  temin edilen   görüntüleme  sistemi ile DNA hasarını kantitatif değerlendirme olanağımız da oldu.2006 yılından beri görevimi Marmara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi,Toksikoloji Anabilim Dalında  sürdürmekteyim.Önemli genotoksisite yöntemlerini Marmara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi  Anabilim dalımızda da arkadaşlarımın desteği ile kurmuş bulunmaktayım.Özellikle comet tekniğini DNA hasarını ve  onarımını belirlemek amacıyla çeşitli projelerde uygulamaktayız.Marmara Üniversitesi proje desteği ile Anabilim Dalımıza temin ettiğimiz ve  çalışmalarımızda  yararlandığımız ,kullanımı, yazılım esnekliği daha kolay  bilgisayar destekli  BAB Bs Comet görüntü ve analiz sistemini yerli olarak üreten , BAB firması sahibi Sayın Babacan Uğuz’ u tebrik ediyoruz ve  desteğine,ayrıca  Anabilim Dalımızda kurulmasına ve öğretim elemanlarının eğitimi konusunda göstermiş olduğu hassasiyeti için teşekkür ediyoruz.

Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi H, Miyamae Y, Rojas E, Ryu JC, Sasaki YF. Single cell gel/Comet Assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ. Mol. Mutagen. 2000; 35: 206-21.

Ostling O, Johanson KJ. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984; 123: 291-98.

Collins AR, Duthie, SJ, Dobson VL. Direct enzymic detection of endogenous oxidative base damage in human lymphocyte DNA. Carcinogenesis. 1993; 14: 1733–735.

 Collins A, Dusinska M, Franklin M, Somorovska M, Petrovska H, Duthie S, Fillion L, Panayiotidis M, Raslova K, Vaughan N. Comet Assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ. Mol. Mutagen. 1997; 30: 139–143

Sayın Prof. Dr. Semra Şardaş  ve arkadaşlarına ait Comet tekniği ile yayınlanmış  bazı Uluslararası  Yayınlarına  Örnekler;

Sardas,S., Walker,D., Akyol,D., Karakaya,A.E.: Assessment of smoking-induced DNA damage in lymphocytes of smoking  mothers newborn infants using the Single Cell Gel Electrophoresis Technique.

Mutation Research, 335: 213-217,  (1995).

 Sardas,S., Aygün,N., Gamlı,M., Ünal,Y., Ünal,N., Berk,N., Karakaya,A.E.: Use of alkaline Comet assay (single cell electrophoresis technique) to detect DNA damage in lymphocytes of operating room personnel occupationally exposed to anaesthetic gases .Mutation Research, 418, 93-100 (1998).

 Sardas,S.,   Karabıyık,L., Aygün,N., Karakaya,A.E.: DNA damage evaluated by the allkaline comet assay in lymphocytes of humans anaesthetized with isoflurane, Mutation Research, 418, 1-6  (1998). 

Baltacı,V., Aygün,N., Akyol,D., Karakaya,A.E., Sardas,S.: Chromosomal aberrations and alkaline Comet assay in families with habitual abortion, Mutation Research 417, 47-55 (1998).

 Karakaya,AE., Sardas ,S., Burgaz,S.: Genotoxic Tests: Application to occupational exposure as biomarkers in “DNA Damage and Repair: Oxygen Radical Effects, Cellular Protection and Biological Consequences” Eds.M.Dizdaroğlu, A.E.Karakaya. Plenum Publishing Corporation. P.181-191(1999).

Öztok, U., Yılmaz, M., Karakoç, A., Çakır, N., Karakaya, A.E., Sardas, S.: Detection of oxidative damage to DNA in diabetes mellitus by comet assay. Neoplasma, 46, Suppl., 1999. 

Kocabas,A,N., Karahalil, B., Karakaya,A,E., Sardas, S.:Influence of GSTM1 genotype on comet assay and chromosome aberrations after induction by bleomcin in cultured human lymphocytes.

Mutation Research, 469,199-205 (2000).

Sardas S., Yılmaz M., Öztok U., Çakır N., Karakaya A.E.: Assessment of DNA strand breakage by comet assay in diabetic patients and the role of antioxidant supplementation.

Mutation Research. 490, 123-129 (2001).

Karabıyık,L., Sardas,S., Polat,U., Kocabas,NA., Karakaya,AE.: Comparison of genotoxicity of sevoflurane and isoflurona in human lymphocytes studied in vivo using the comet assay.

Mutation Research.  492, 99-107, (2001).

Biri A., Civelek E., Karahalil B., Sardas S. : Assessment of DNA Damage in Women Using Oral Contraceptives.Mutation Research, 521 (1-2): 113-9 (2002).

Eren K., Ozmeric N., Sardas S.: Monitoring of buccal epithelial cells by alkaline comet assay (single cell gel electrophoresis technique) in cytogenetic evaluation of chlorhexidine.

Clin Oral Investig, 6(3): 150-4 (2002).

Baltacı, V., Şardaş, S.; Aytaç, B., Cakar, S., Karakaya, AE.: Assessment of Cytogenetic Aberrations and Comet Assay In Colorectal Adenocarcinomas.

Tumori, 89:305-310 (2003).

Sardas S.: The role of antioxidants in cancer prevention and treatment.

Indoor and Built Environment. 12:401-404 (2003).

Cok I., Sardas S., Kadioglu E., Ozcagli E., Assessment of DNA damage in glue sniffers by alkaline comet assay.

Mutation Research. 557:131-136 (2004).

Kaymak C, Kadioglu E., Basar H., Sardas S.: Genoprotective Role of Vitamin-E and Selenium in rabbits Anaesthetized with sevoflurane.

Human and Experimental Toxicology, 23;413-419 (2004)

Kadıoğlu E, Şardaş S, Aslan S,Isık E,Karakaya AE.;Detection of Oxidative DNA Damage in Lymphocytes of Patients with Alzheimer’s disease.

Biomarkers, 9;203-209 (2004)

Boyaci B, Yalcin R, Cengel A, Erdem O, Dortlemez O, Dortlemez H, Sardas S;

.Evaluation of DNA Damage in lymphocytes of cardiologists exposed to radiation during cardiac catheterization by the. Comet assay Jpn Heart J . Sep;45(5):845-53(2004

Karakaya, A.E., Ozcagli E., Ertas N., Sardas S.; Assessment of abnormal DNA repair responses and genotoxic effects in lead exposed workers. American Journal of Industrial Medicine 47(4): 358-63, (2005).

Ozcagli E., Sardas S.; Biri A., Assessment of DNA damage in postmenopausal women under hormone replacement therapy. Maturitas, 51(3): 280-5. (2005)

Şardaş S.;Genotoxicity tests and their use in Occupational Toxicology as Biomarkers.

Indoor and Built Environment, Vol. 14, No. 6, 521-525 (2005)

Bayram M,Soyer C,Kadıoglu E,Sardas S.;

Assessment of DNA damage in postmenopausal women under osteoporosis therapy.

Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2006 Feb 25; [Epub ahead of print] 

Sardas S,Izdes S,Ozcaglı E,Kanbak

The role of antioxidant supplementation in occupational exposure to waste anaesthetic gases.
Int Arch Occup Environ Health. 80(2):154-9. 2006

Atesagaoglu A,Omurlu H,Ozcaglı E,Sardas S,Ertas N.

Mercury exposure in dental practice
Operative Dentistry. 31(6):666-9. 2006

 Kaymak C ,  Kadioglu E , Ozcagli E ,  Osmanoglu E ,  Izdes S , Agalar C , Basar H

 Sardas S ; Oxıdatıve DNA  damage and total antıoxıdant status ın rats durıng experımental gram-negatıve sepsıs. Human & Experimental Toxicology. In press.2008